La citometria a flusso consente di determinare le
caratteristiche fisiche e chimiche delle cellule mentre fluiscono in un
mezzo liquido. Tale tecnica si basa sulla spettrometria di fluorescenza
che permette di misurare le intensità di fluorescenza
(emissione
da parte di una molecola che ha assorbito una radiazione di
un’
altra radiazione con lunghezza d’onda maggiore). Il
suo
utilizzo è molto frequente in biologia cellulare in cui le
cellule sono marcate con diversi fluorocromi. La citometria a flusso
è costituita da un sistema complesso che comprende sorgenti
luminose, sistemi ottici (lenti, diaframmi e feltri), sistemi
idrodinamici per il trasporto delle cellule, un sistema di trasduttori
che traduce il segnale da luminoso a elettrico ed infine un
sistema di analisi dei dati.
L’analisi citometrica riporta un istogramma di frequenza in
cui
in ascissa abbiamo l’intensità di fluorescenza in
termini
di “numero di canali” (una volta che nella macchina
il
segnale ottico è tradotto in elettrico, gli impulsi
elettrici
sono convertiti in canali) e in ordinata il numero di cellule per
canale.
In laboratorio abbiamo usato la citofluorimetria per osservare la
percentuale di cellule nelle fasi del ciclo cellulare marcando il DNA
delle cellule. Quindi abbiamo preparato nuclei isolati di cellule HL60
che sono state messe in Falcon 15 mL e centrifugate a 1.200
RPM
per 10 min. Al pellet è aggiunta una soluzione 15 mL di
citrato
di sodio, RNasi, Nonidet P40 e propidio ioduro. Riposo in incubatore a
37°C per 30 minuti.
Dalla lettura al citofluorimetro è risultato che le mie
cellule
erano poche mentre una buona parte di esse si trovava in apoptosi in
quanto la fluorescenza del DNA era più debole. Per quanto
riguarda le cellule in vita di esse è risultato che il 41%
nel
canale 47 risultano in fase del ciclo G0 G1 ; un altro 41% nel canale
88 si trova in fase G2 M (con intensità di fluorescenza
doppia);
infine un 30,5% si trova in fase S (il DNA è intermedio tra
e
due fasi precedenti).