Conteggio delle cellule e curva di crescita
Per stabilire lo stato di salute delle cellule e per vedere se
crescono bene, esse vengono contate. Si possono contare con varie
tecniche. Nel nostro corso abbiamo utilizzato il contatore automatico e
la camera di Burker.
Abbiamo prelevato, dopo aver sospeso bene in fiasca, due dosi da 0.5 mL
di cellule e le abbiamo messe in due bicchierini a ciascuno
dei
quali abbiamo aggiunto 4,5 mL di PBS. Essi sono stati poi inseriti nel
contatore che mostra i risultati di conteggio delle cellule tra 8 e 18
µm e > 18 µm (considerati come possibili
agglomerati di
cellule). Ecco i risultati per una settimana di conteggio delle
HL60.
Contando le mie cellule HL60 con il contatore automatico ho raccolto i
loro valori di crescita nella seguente tabella:
|
DATA |
TEMPO IN H |
NUMERO DI
CELLULE |
|
11/12/2006 |
0 |
202360 |
|
12/12/2006 |
23 |
234910 |
|
13/12/2006 |
47 |
252350 |
|
14/12/2006 |
71 |
488320 |
Da tali dati risulta questa curva di crescita:
Se si calcola il numero di cellule su scala logaritmica:
|
TEMPO IN H |
0 |
23 |
47 |
71 |
|
N°CELL/mL |
202360 |
234910 |
252350 |
488320 |
|
LOG N°
CELLULE |
5,31 |
5,37 |
5,4 |
5,69 |
Ad essa corrisponde la seguente curva linearizzata:
CALCOLO DEL TEMPO DI GENERAZIONE
Se io inoculo n0 cellule al tempo t0 dopo z generazioni si ha che :
Log n = log n0 +z log 2
Da cui
Z = t / T
Dove :
t = tempo che intercorre tra 2 conteggi.
T = tempo di generazione.
|
GIORNO |
z |
t |
Tgenerazione |
|
12/12/2006 |
0,2 |
23 |
115 |
|
13/12/2006 |
0,3 |
24 |
80 |
|
14/12/206 |
1,6 |
24 |
15 |
I miei calcoli non rispettano il tempo medio di generazione ideale che dovrebbe essere circa uguale a quello di 24 h. In più Tgenerazione=15 non sembra un reale tempo di duplicazione di cellule quanto di batteri, però corrisponde alla fase del grafico in cui vi è un aumento esponenziale della crescita .
CONTEGGIO ALLA CAMERA di BURKER
Solo nella giornata del 07/12/06 si è effettuata tale tipo di conteggio. Abbiamo prelevato una piccola quantità di campione e ne abbiamo fatto diffondere una goccia nel nella camera di conteggio.
N.B.: ho effettuato la colorazione con il Trypan blu che diffonde solamente nelle cellule morte o danneggiate.
Ho contato le cellule lungo i 5 quadrati più grandi sulle diagonali della griglia (ciascuno 1/10 µm) per cui per trovare il
Numero di cellule in 1mL = N/5×10×1000(escluse le cell. colorate con Trypan)
Con N=(10+23+14+26+27)/5=100/5=20cell. in media a quadratino.
Da cui: 100/5×10×1000 = 200.000cell su mL.